RMN

RMN (Ressonância Magnética Nuclear) é usada como método de análise padrão para a determinação estrutural de um composto orgânico. Na análise da RMN, a razão do número dos núcleos atómicos num composto corresponde à razão das áreas dos picos no espectro.

Uma amostra e um padrão (um padrão interno) com uma conhecida pureza são misturados e dissolvidos num solvente deuterado. Um valor quantitativo da pureza da amostra pode ser calculado a partir da relação entre a superfície dos picos espectrais originados a partir da amostra e do padrão, do número de protões, das massas e dos pesos moleculares da amostra e do padrão.

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Solventes NMR - A qualidade é essencial

Em síntese orgânica, os cientistas necessitam de utilizar o método mais importante na análise estrutural de moléculas orgânicas - a espectroscopia por RMN. Temos uma vasta gama de solventes de elevada pureza > 99,9%), dif. graus deuteração.

Padrões RMN

Merck Supelco oferece um conjunto de materiais de referência certificados rastreáveis a NIST SRM para usar como padrões internos em estudos RMN quantitativos. A oferta inclui padrões qNMR para experiências 1H, 31P e 19F NMR.

Perguntas frequentes

A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma técnica espectroscópica que pode ser usada para obter propriedades estruturais e dinâmicas das moléculas explorando o comportamento de certos átomos quando colocados em ímanes supercondutores muito potentes (180 000 até 360 000 vezes mais fortes do que o campo magnético da terra em UConn Health). Quando os núcleos de RMN ativos são colocados num campo magnético forte, os seus núcleos alinham com o campo e começam a processar a uma frequência dependente da razão isotrópica girométrica e da força do campo magnético aplicado, juntamente com o ambiente químico e físico do átomo. O componente da frequência que é dependente do ambiente químico e físico é chamado de deslocamento químico. Os experimentos da RMN perturbam o alinhamento ao aplicarem pequenos impulsos de energia da Frequência de Rádio (FR) para determinar o deslocamento químico de cada átomo ativo RMN na molécula que está a ser estudada. Recorrendo a combinações de impulsos e atrasos (isto é conhecido como uma sequência de impulso), é possível verificar informação adicional, como por exemplo quais os átomos que estão ligados entre si e quais os átomos que estão perto uns dos outros em termos de espaço. Através da utilização de diferentes experimentos, é possível determinar a estrutura tridimensional das moléculas, incluindo grandes biomoléculas, tais como proteínas.

As investigações da RMN de alta resolução são mais viáveis para proteínas inferiores a 25 kDa aproximadamente em massa e solúvel até cerca de 0,5 mM. Em certos casos, pode ser possível investigar proteínas ou complexos de tamanho maior ou de menor solubilidade. As proteínas de membrana são difíceis de estudar com recurso a métodos de elevada resolução, mas estão a emergir novas técnicas que podem ser aplicadas. Pelo facto dos estudos da RMN exigirem normalmente identificação, deve estar disponível a proteína com isótopos estáveis 15N, 13C, e por vezes 2H (um sistema de expressão adequado ao crescimento em meios rotulados). As proteínas devem estar purificadas (normalmente requer >95%), dobrados e pelo menos marginalmente estáveis. Recomenda-se a caracterização preliminar por dicroísmo circular e termal ou desnaturação de solvente.

Esta questão é difícil de responder, pois depende das questões que são feitas e do comportamento da amostra. Normalmente é precisa uma amostra de 300 µl (com tubos RMN especializados) a 600 µl. As concentrações de proteína para sistemas bem comportados devem estar acima de 150 µM para estudos estruturais, mas devem ser usadas concentrações mais baixas para outros estudos não estruturais. Enquanto 150 µM é uma estimativa aproximada para a concentração mais baixa para usar em estudos estruturais, é aconselhável fazer as concentrações de proteína o mais altas possíveis, e devem ser limitadas pela solubilidade e comportamento da proteína e não pela quantidade de proteína preparada. A quantidade de tempo usado para operar experimentos mais longos para compensar as baixas concentrações e o maior tempo necessário para interpretar o espectro da RMN serão quase de certeza maiores do que o tempo necessário para preparar uma amostra adicional.

Assim que a amostra tiver sido suficientemente purificada e secada, o próximo passo é escolher um solvente adequado. Uma vez que deutério é, de longe, o núcleo de fecho mais popular, a amostra é normalmente dissolvida num solvente deuterado (um solvente deuterado é aquele, no qual uma grande proporção, normalmente mais de 99%, dos átomos de hidrogénio foram substituídos por deutério). Os solventes habitualmente usados são acetona-d6, benzeno-d6 e clorofórmio-d, apesar de estarem disponíveis muitos outros solventes.

Fatores a ter em conta quando escolher um solvente:

1. Solubilidade:

  • Naturalmente que quanto mais solúvel for a amostra, melhor será. Isto maximiza a quantidade de amostra dentro do volume sensível, o que aumenta a sensibilidade do experimento. A elevada solubilidade é particularmente importante se estiverem disponíveis apenas pequenas quantidades da amostra.

2. Interferência de sinais de solventes com o espectro da amostra

  • O próprio solvente vai inevitavelmente produzir sinais da RMN, que vão obscurecer regiões do espectro. Estes ‘picos de solventes residuais’ não devem sobrepor-se com sinais da amostra.

3. Dependência de temperatura:

  • Para experimentos acima ou abaixo da temperatura ambiente, a fusão dos solventes e os pontos de ebulição são igualmente fatores importantes. Além disso, a solubilidade da amostra varia com a temperatura.

4. Viscosidade:

  • Quanto mais baixa for a viscosidade do solvente, melhor é a resolução do experimento.

5. Custo:

  • Naturalmente que para a RMN de rotina, onde têm de ser medidas muitas amostras, o custo do solvente é um fator importante a considerar. Regra geral o preço aumenta com o número de átomos deuterados.

6. Teor de água:

  • Quase todos os solventes da RMN contêm vestígios de água. E muitos são hidroscópicos (absorvem água da atmosfera) e, por isso, quanto mais tempo estão guardados, mais água contêm. A presença de um pico de água (HDO) apenas vai servir para degradar a qualidade do espectro da RMN. O nível de água no solvente pode ser fortemente reduzido pela filtração através de um agente de secagem ou pelo armazenamento do solvente em peneiros moleculares.
  • A escolha do solvente para uma determinada amostra será o melhor compromisso entre as várias vantagens e desvantagens de cada. Para detalhes precisos de solventes específicos, consulte o texto RMN padrão.